Comment éviter la contamination par les kératines ?
Il est indispensable de prendre les précautions suivantes pendant toutes les étapes de manipulation de vos échantillons pour limiter la contamination par les kératines qui nuirait à la qualité de vos résultats :
- évitez de porter des vêtements en laine
- attachez les cheveux longs
- portez une blouse propre et bien recouvrir vos avant-bras
- portez des gants propres
- nettoyez la paillasse sur laquelle vous manipulez avec de l’éthanol
- évitez de pencher le visage au dessus de vos échantillons et éventuellement portez un masque
- utilisez des équipements parfaitement propres (lavage à l’eau chaude savonneuse et rinçage à l’eau milliQ) (matériel de migration, boîtes pour la coloration, outils de découpes des bandes de gels, tubes à l’abri de la poussière, etc.)
- utilisez des solutions et des équipements dédiés à l'analyse en spectrométrie de masse et en particulier différents de ceux utilisés pour le western-blot.
Extraction protéique
L’extraction protéique est une étape primordiale de l’analyse protéomique. Si vous réalisez vous-même l’extraction, nous pouvons vous fournir un protocole.
Migration sur gel d’électrophorèse 1D ou 2D
Type de gels:
L’utilisation de gels précoulés et des tampons achetés limite les contaminations par la kératine. Si vous préparez vos gels vous-même, suivez bien les recommandations pour éviter les contaminations.
Quantité d'échantillon:
Nous recommandons de déposer entre 20 et 50 µg de protéines totales par puits en gel 1D, entre 60 et 120 µg en gel 2D coloré au NiAg, entre 100 et 600 µg en gel 2D coloré au bleu de Coomassie.
Coloration du gel:
Ne pas utiliser de bacs ayant servi pour des expériences de Western Blot pour éviter toute contamination par les protéines utilisées pour saturer les membranes (caséine, albumine,…) ou de bacs en plastiques pour éviter toute contamination par les polymères !
Coloration au bleu de Coomassie :
Utilisez un bleu de Coomassie colloïdal car il est compatible avec l’analyse par spectrométrie de masse.
Coloration au nitrate d’argent :
La coloration au nitrate d’argent classique n’est pas compatible avec l’analyse par spectrométrie de masse. Il est néanmoins possible de réaliser une coloration au nitrate d’argent compatible avec la spectrométrie de masse en utilisant un protocole particulier.
Consultez-nous si vous souhaitez réaliser une coloration au nitrate d’argent. Attention, la coloration au nitrate d’argent est très sensible et peut correspondre à une quantité de protéine insuffisante pour fournir une identification par spectrométrie de masse. Nous vous recommandons la coloration au bleu de Coomassie.
Excision des bandes/spots de gel
L’étape d’excision des bandes est particulièrement critique pour la contamination par la kératine :
- nettoyez avec soin la plaque de verre sur laquelle vous réaliserez l’excision avec de l’éthanol
- portez des gants propres comme pour les autres étapes et un masque
- utilisez un scalpel, ou un emporte-pièce nettoyé à l’éthanol
Si vous vous intéressez à une bande en particulier, celle-ci devra être découpée le plus précisément possible pour éviter la contamination par une protéine issue d’une bande adjacente. La bande de gel peut ensuite être placée dans un tube Eppendorf, après avoir été découpée en petits de cubes de quelques mm2.
Conservation et envoi des échantillons
Spots de gel 2D ou bandes de gel 1D :
- Si les échantillons sont amenés en main propre : les mettre à 4°C dans un tube Eppendorf rempli d’eau pour utilisation immédiate ou ajout d’acide acétique (0.1%) en cas de conservation prolongée à -20°C.
- Si les échantillons sont envoyés par courrier : les mettre à température ambiante dans eau/acide acétique (0.1%), bien protégés (papier à bulle par exemple).
Tissue, cellules et protéines en solution:
Les échantillons seront envoyés à la plate-forme congelés en colis carboglace ou remis en main propre congelés.
Dans les deux cas, joindre la fiche renseignement échantillon complétée.
Gestion et stockage des échantillons sur la plate-forme
La conformité des échantillons par rapport au cahier des charges établi (identification, nombre, type, qualité de conservation) est vérifiée à réception. La plate-forme s’autorise à refuser des échantillons qui lui seront délivrés dans de mauvaises conditions. Les échantillons sont conservés jusqu’à la fin du projet, dans un congélateur -80°C équipé d’une alarme via message électronique et dont la température est enregistrée en continu. Après la remise des résultats, les échantillons restants seront traités comme indiqué par le laboratoire demandeur dans la fiche projet (destruction, renvoi à la charge du laboratoire demandeur, changement de finalité).
Attention aucun échantillon présentant un risque biologique, radiologique ou toxicologique avéré ne sera traité sur la plate-forme. De tels échantillons seront ainsi préparés dans le laboratoire demandeur.
