Est-il possible d'identifier une protéine dont la présence est confirmée par western-blot?
Les vérifications de western blot, qui est une technique d'amplification spécifique d'un signal, par la spectrométrie de masse sont très délicates à entreprendre. En effet, à l'endroit du gel où l'on révèle la protéine d'intérêt par western blot peuvent aussi co-migrer plusieurs dizaines d'autres protéines, qui selon leurs abondances peuvent empêcher l'identification de cette protéine d'intérêt par spectrométrie de masse (gamme dynamique de l'échantillon). Pour faire simple, si on n'identifie pas la protéine d'intérêt, cela ne signifie pas forcement qu'elle n'est pas présente dans la bande mais elle peut être masquée par des protéines co-migrantes plus abondantes qui sont quant à elles identifiées.


Pourquoi le poids moléculaire théorique de la protéine identifiée ne correspond pas au poids moléculaire observé sur gel?
Les poids moléculaires affichés dans les bases sont calculés à partir des séquences théoriques des protéines traduites de l'ARNm correspondant. Toutes les modifications post-traductionnelles des protéines, pouvant affecter leur poids moléculaires, ne sont ainsi pas pris en compte. Par exemple une protéine sécrétée qui possède un peptide signal clivé lors de sa maturation ou une proprotéine clivée pour donner la protéine mature auront une masse moléculaire théorique plus grande dans les bases de données par rapport à leur masse observée sur gel. A l'inverse une protéine membranaire glycosylée aura une masse moléculaire  théorique plus faible dans les bases de données par rapport à la masse observée sur un gel.

 

Des kératines ont été identifiées dans mon échantillon. Cela vient-il de de moi ou de vous ?

Pour éviter les contaminations par les kératines, nous réalisons les fractionnements de nos échantillons dans une salle blanche. Cela signifie que les kératines proviennent des échantillons fournis qui sont contaminés la plupart du temps lors de la préparation des échantillons ou lors de la séparation des protéines sur gel d’acrylamide pendant les étapes de coloration ou de découpe des bandes. Si la contamination n’est pas trop importante, les kératines peuvent être ignorées. Dans notre guide de préparation des échantillons, nous vous donnons des conseils sur la manière de diminuer la contamination par les kératines de vos futurs échantillons.

 

Plusieurs protéines sont identifiées dans ma bande de gel, comment cela se fait-il?

Une bande de gel 1D ne contient que très rarement une seule protéine.  En effet la sensibilité des spectromètres de masse dépasse celle des colorations de gels (i.e., Coomassie et nitrate d’argent). Plusieurs protéines peuvent être identifiées dans une bande de gel, cela dépend de la complexité de l’échantillon déposé sur le gel. N’oubliez pas que votre protéine d’intérêt peut être présente en quantité inférieure au seuil de détection de la méthode de coloration utilisée. Surcharger une piste de gel est aussi une erreur courante qui peut affecter la résolution et la séparation des protéines. Cela entraine également une fixation des protéines abondantes sur la colonne de chromatographie liquide en amont du spectromètre de masse, ce qui conduit à l’identification de la même protéine dans différents échantillons.

 

 Comment puis-je être sûr que ma protéine est correctement identifiée ?

L’identification de protéines par spectrométrie de masse se fait en recherchant dans des bases de données les spectres peptidiques théoriques correspondant le mieux aux spectres peptidiques expérimentaux acquis. Cette comparaison de spectres se fait à l’aide de logiciel dédié fournissant un score qui reflète la probabilité que cette correspondance soit bonne. De plus le nombre de fausses identifications est estimé par le calcul d’un taux de faux positif dans le jeu de données (FDR). Les identifications sont ensuite validées en ne prenant en compte que les meilleures correspondances de spectres avec un FDR < 1%. Les protéines passant ces critères avec plusieurs peptides sont donc identifiées avec confiance. Pour les protéines identifiées avec un seul peptide, il est en général nécessaire de vérifier manuellement l’annotation des spectres pour valider l’identification.

 

 Est-il possible de séquencer une protéine par spectrométrie de masse ?

Les analyses classiques de protéines par spectrométrie de masse ne sont pas à proprement parlé des méthodes de séquençage de protéines. Ces analyses sont basées sur des correspondances de spectres expérimentaux et théoriques pour l’identification des protéines, comme nous l’avons vu dans la question précédente. Ainsi nous n'obtenons que dans de très rares conditions (échantillon pur en quantité importante et protéoforme répertoriée dans une base de donnée), une couverture de séquence de 100% avec une analyse classique, nous permettant d'être certain de la séquence des protéoformes détectées.