Mass spectrometry global analysis of phosphorylated proteins in a complex sample is an important challenge among the post-translational modifications analysis because phosphoproteins are low abundant proteins and are present at substoichiometric levels. Moreover, this modification is labile leading to a difficult detection by mass spectrometry. In order to identify the maximum number of phosphoproteins in a sample, it is necessary to optimize the protein extraction, the phosphopeptides enrichment and the mass spectrometry analysis steps.

The method we use for phosphoproteome analysis is based on the enrichment of mono- and multiphosphorylated peptides according to the SIMAC (Sequential Elution from IMAC) method and on a combination of 3 different mass spectrometry acquisition methods: a CID mode, a Neutral Loss mode and a Multistage Activation mode.

 

Publications with our lab :

Colinet et al., 2017 Scientific Reports. 2017; 7(1): 1713. doi: 10.1038/s41598-017-0197.

 

Références:

Thingholm et al., 2008, Mol Cell Proteomics 7(4): 661-671. doi: 10.1074/mcp.M700362-MCP200.

Engholm-Keller et al., 2013, Proteomics 13(6): 910-931. doi : 10.1002/pmic.201200484.

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La technique des peptides AQUATM (Absolute QUAntification) est une approche d'analyse ciblée qui permet de réaliser la quantification absolue de protéines contenues dans un échantillon biologique
Cette technique repose sur le principe du standard interne marqué par des isotopes stables qui est classiquement utilisé pour les méthodes de quantification par spectrométrie de masse. Un peptide natif issu de la digestion de la protéine à quantifier est tout d’abord sélectionné selon plusieurs critères pour représenter la protéine.
 
Le peptide AQUA est un peptide synthétique qui possède la même séquence d’acides aminés que le peptide natif sélectionné mais qui comporte un acide aminé alourdi par plusieurs isotopes stables (13C, 15N, 2D) permettant d’augmenter la masse du peptide de 6 à 10 Da.
 
Après la digestion trypsique de l’échantillon dans lequel est contenu la protéine à quantifier, le peptide AQUA est ajouté en quantité connue en tant que standard interne.L’échantillon est ensuite analysé par nano-chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse (nanoLC-MS). Le peptide natif et le peptique AQUA sont détectés au même temps de rétention et possèdent les mêmes propriétés d’ionisation mais sont facilement distingués en spectrométrie de masse par la différence de masse due au marquage isotopique. La quantité de peptide natif peut alors être déterminée à partir du rapport d’intensité observé entre le signal correspondant au peptide natif et le signal correspondant au peptide AQUA présent en quantité connue. Idéalement, un deuxième peptide AQUA peut être sélectionné pour confirmer la quantification.
peptide aqua
Exemple d’application de la technique :
Quantification absolue de protéines pour lesquelles les méthodes de quantification immunologiques ne sont pas applicables.
Champs d’application :
Protéines cytosolubles et membranaires
Fluides biologiques
 
Exemple de travaux réalisés sur notre site:
Papaioannou MD, Lagarrigue M, et al., 2011, Mol Cell Proteomics, 10(4):M900587MCP200.