La technologie Label-Free
 
La technologie Label-Free regroupe différentes méthodes de quantification relative de protéines qui ne nécessitent pas de marquage isotopique.  Contrairement aux méthodes de quantification basées sur un marquage isotopique, les échantillons à comparer sont analysés séparément. Les méthodes Label-Free fournissent donc un résultat de quantification moins précis que les méthodes  basées sur le marquage isotopique mais elles permettent de comparer un plus grand nombre d’échantillons et constituent donc une alternative très intéressante.

Les approches Label-Free sont basées soit sur l’intensité des peptides détectés, soit sur le nombre de spectres MS/MS acquis pour chaque peptide (spectral count). Protim utilise ces deux approches et s’appuie sur les outils de quantification Label-Free du logiciel Proline développé par ProFi (Infrastructure Française de Protéomique ; www.profiproteomics.fr). Nous utilisons également la méthode « Top 3 » basée sur la mesure d’intensité des 3 peptides les plus intenses disponible dans le logiciel ProteomeDiscoverer (Thermo Scientific) utilisé pour l’analyse des données Orbitrap.
 
 

Exemple d’application:
Recherche de protéines différentiellement exprimées dans des cellules ou des tissus après traitement ou induites par un état pathologique

Comparaison de deux échantillons plus ou moins complexes
 
Champs d’application :
Protéines cytosolubles et membranaires

Fluides biologiques
 
Exemple de travaux réalisés sur notre site:
Becker et al., 2017, J Proteomics.; 156: 5-19. doi: 10.1016/j.jprot.2016.12.016.

Colinet et al., 2017 Scientific Reports. 2017; 7(1): 1713. doi: 10.1038/s41598-017-01974-z.

La technique ICPL® (Isotope-Coded Protein Label)
 
Elle permet l’analyse comparative de deux (ICPL duplex) ou trois (ICPL triplex) échantillons protéiques complexes. L'analyse ICPL duplex:

Après dénaturation et alkylation, les deux échantillons protéiques sont marqués sur les lysines avec un réactif ICPL (12C/13C6 – Nicotinic acid-succinimide) : l’un avec le réactif léger et l’autre avec le réactif lourd. La différence de masse entre les réactifs lourd et léger est de 6 Da. Après mélange des deux échantillons, les protéines sont séparées suivant des techniques biochimiques classiques puis sont digérées.

Les peptides de digestion ainsi générés sont ensuite analysés par LC-MS/MS sur notre spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Les protéines différentielles sont mises en évidence par le calcul des ratios des paires de peptides lourd/léger détectés et identifiés par spectrométrie de masse.
ICPL
 
Exemple d’application de la technique :
Recherche de protéines différentiellement exprimées dans des cellules ou des tissus après traitement ou induites par un état pathologique
 
Champs d’application :
Protéines cytosolubles et membranaires
Fluides biologiques

Exemple de travaux réalisés sur notre site:
Papaioannou MD, Lagarrigue M, et al., 2011, Mol Cell Proteomics, 10(4):M900587MCP200.
Com E, et al., 2012, Journal of Proteomics, 75(13): 3898-3913.
 
Références :
Schmidt A. et al., 2005 Electrophoresis 5 : 4-15

L’électrophorèse 2D-DIGE (DIfferential Gel Electrophoresis) est une technique d’analyse différentielle de protéines sur gels bidimensionnels séparant les protéines en fonction de leur point isoélectrique et de leur masse.
 
Les échantillons protéiques à analyser sont marqués avec des fluorochromes différents possédant la même masse mais ayant des longueurs d’onde d’excitation et d’émission différentes. Ainsi, deux échantillons marqués avec des fluorochromes différents vont être mélangés et séparés sur un même gel. L’acquisition d’images aux longueurs d'onde spécifiques de chaque fluorochrome permet d’obtenir 2 images qui pourront être comparées en s’affranchissant des variations de migration entre gels, souvent observées lors d’analyses réalisées avec des gels bidimensionnels classiques.
 
Un autre avantage de cette technique est l’utilisation d’un standard interne pour la comparaison de plusieurs échantillons déposés sur plusieurs gels. Celui-ci est un mélange de tous les échantillons à analyser et possède ainsi toutes les entités protéiques de tous les échantillons. Cela facilite la correspondance entre les gels lors de l’analyse d’image mais permet également de calculer les ratios d’expression de chaque protéine sur un gel et de normaliser ces ratios d’expression entre les différents gels grâce à l’utilisation d’un logiciel d’analyse d’image dédié (Decyder). Ce logiciel permet également l’analyse statistique des ratios d’expression.
 
schema dige
 
 
Exemple d’application:
Recherche de protéines différentiellement exprimées dans des cellules ou des tissus après traitement ou induites par un état pathologique
 
Champs d’application :
Protéines cytosolubles et protéines sécrétées
 
Exemple de travaux réalisés sur notre site:
Rolland et al., 2007, J Proteome Res 6(2) : 683-697.
Collet et al., 2011, Proteome Science 9(1):16.
Gondret et al., 2012, J Proteomics 75(3):949-61.
Lincet et al., 2012, J Proteomics 75(4):1157-69.
Colinet et al., 2012, PloS ONE 7(2): e32606.
 
Revue:
Com et al., 2011, Methods Mol Biol 691:187-203.
 
Références :
Unlü M. et al., 1997 Electrophoresis 18 : 2071-7.
Alban A. et al., 2003 Proteomics 3 : 36-44.
boule disco