Identification de protéine par empreinte peptidique
Les protéines d'intérêt, séparées sur gel 2D en général, sont excisées puis soumises à une digestion enzymatique contrôlée, par une endoprotéase. Compte tenu de sa spécificité, la trypsine est l'enzyme la plus couramment utilisée. Elle clive les protéines après les résidus Lysine et Arginine excepté lorsque ceux-ci sont suivis d'un résidu Proline. La digestion de protéines par la trypsine génère, en général, des peptides de 800 à 3000 Da, analysables par spectrométrie de masse.
L'ensemble des peptides issus de cette digestion enzymatique constitue une empreinte peptidique et leur analyse par un spectromètre de masse de type MALDI-TOF ou MALDI-TOF/TOF permet de déterminer leur masses de manière très précise. Cette liste de masses, spécifique de la protéine d'intérêt, est ensuite exportée dans des moteurs de recherches dédiés à l'analyse protéomique pour permettre un criblage de banques de séquences.
Ces logiciels réalisent une digestion théorique de toutes les séquences protéiques répertoriées dans ces banques, incluant les séquences protéiques issues de la traduction de séquences nucléotidiques, et compare la liste des masses expérimentales avec celle des masses théoriques calculées. Lorsqu'un certain nombre de concordances sont mises en évidence (nombre de peptides observés dont la masse correspond à celle des peptides théoriques, précision de masse, pourcentage de séquence couverte,etc...), il y a identification.
Cette technique est utilisée pour l'identification d'une protéine majoritaire dans un mélange peu complexe (spot de gel 2D ou bande visible de gel 1D). Elle ne s'applique pas aux mélanges complexes de protéines.
Informations de séquences peptidiques par spectrométrie de masse en tandem
L'analyse par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) permet de générer des informations de séquences sur les peptides issus d'une digestion trypsique et peut être utilisée comme alternative lors d'un échec d'identification par empreinte peptidique ou pour identifier un nombre important de protéines dans un mélange complexe.
Les peptides de digestion trypsique sont ionisés par ESI (electrospray ionization) ou MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization), séparés dans un analyseur puis détectés pour donner un spectre MS. Dans une expériences MS/MS, un ion de rapport m/z (masse sur charge) particuler, appelé ion précurseur, est sélectionné puis fragmenté en ions fragments. Ces ions fragments sont ensuite eux-même séparés et détectés pour donner un spectre de masse MS/MS.
Les masses des ions observés sur le spectre MS/MS constituent une représentation de la séquence protéique. Lorsqu' un acide aminé est perdu lors de la fragmentation MS/MS du peptide sélectionné, deux pics présentant une différence de masse correspondant à la masse de cet acide aminé perdu sont obervés. L'analyse approfondie de l'enchainement de ces pics permet de déterminer une partie de la séquence du peptide et donc d'identifier la protéine de départ.
Cette technique est utilisée pour identifier des protéines dans un mélange complexe ou valider une identification par empreinte peptidique.